三、DHA生產(chǎn)理論研究

1、DHA的代謝途徑

1.1 DHA的分解代謝

天然不飽和脂肪酸多為順式，需轉(zhuǎn)變?yōu)榉词綐?gòu)型,才能被β-氧化酶系作用，進(jìn)一步氧化分解。在生物體內(nèi)，不飽和脂肪酸的氧化需要更多酶的參與才能順利進(jìn)行，由于雙鍵的存在，使DHA比飽和及單不飽和脂肪酸更難氧化分解。DHA不能在線粒體中β-氧化，而是被過(guò)氧化物酶體氧化，皮膚表皮15-脂氧合酶的活性非常高，將DHA轉(zhuǎn)化為17-羥基二十碳六烯酸。DHA被哺乳動(dòng)物吸收后，絕大部分結(jié)合成甘油三酯。

1.2 DHA的合成代謝

哺乳動(dòng)物自身不能合成DHA，但可由攝食的油酸、亞油酸或亞麻酸轉(zhuǎn)化而成。在動(dòng)物體內(nèi)，攝食的油酸或亞油酸主要轉(zhuǎn)化為AA，而合成的DHA極少且緩，人體內(nèi)DHA主要由植物油亞麻酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，由于轉(zhuǎn)化涉及3種酶（其中△6去飽和酶為限速酶）的代謝過(guò)程，因此轉(zhuǎn)化效率較低。

微生物合成多價(jià)不飽和脂肪酸通常是在單不飽和脂肪酸基礎(chǔ)上開(kāi)始，合成機(jī)制與高等生物一致，包括延長(zhǎng)碳鏈和去飽和作用兩個(gè)過(guò)程，分別由相應(yīng)的膜結(jié)合延長(zhǎng)酶和脫飽和酶催化，使碳鏈增長(zhǎng)；脂肪酸脫飽和體系由微粒體膜結(jié)合的細(xì)胞色素 b5、NADH-細(xì)胞色素b5還原酶和脫飽和酶組成。微生物合成 DHA是從油酸開(kāi)始，其脫飽和途徑是ω-3；供體（乙酰CoA或丙二酰單酰CoA）提供兩 個(gè)碳原子，在 12、13位C原子之間引入一個(gè)雙鍵，形成亞油酸，再在15、16位碳原子間引入一個(gè)雙鍵， 形成α-亞麻酸，再經(jīng)進(jìn)一步的碳鏈延長(zhǎng)和脫飽和而形成DHA.

2、影響微藻培養(yǎng)生產(chǎn)DHA 的理化因素

2.1 物理因素

影響微藻生長(zhǎng)生產(chǎn)DHA的物理因素有光照、溫度、溶氧量、鹽度、pH值等。

（1）光照：脂肪酸的合成具有藻種的特異性。

（2）溫度：不同的溫度對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)具有較大的影響。隨溫度的升高，藻細(xì)胞的代謝和呼吸作用加快，生長(zhǎng)速率增大。而隨溫度的減低，藻細(xì)胞的代謝和呼吸作用降低。細(xì)胞內(nèi)的多不飽和脂肪酸累積量逐漸增大，DHA含量也逐漸增大。

（3）鹽度：鹽度對(duì)微藻脂肪酸組成的影響因種而異。一般來(lái)說(shuō)，在高鹽濃度下，多不飽和脂肪酸的含量下降。而在適宜的鹽度時(shí)，DHA含量隨著鹽度的升高而增大。

（4）溶氧量：在脂肪酸的代謝途徑中，分子氧參與脂肪酸的去飽和過(guò)程是多不飽和脂肪酸合成過(guò)程的限制因子，微藻發(fā)酵生產(chǎn)DHA的含量也受氧濃度的影響。一般來(lái)說(shuō)，高濃度的溶氧中生產(chǎn)的DHA含量大于低濃度中的DHA含量。

（5）pH值：不同的微藻都有其適宜的pH值。它不僅影響了微藻細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡，也影響了藻細(xì)胞膜的通透性。

此外，培養(yǎng)周期、培養(yǎng)密度、保存方式也對(duì)微藻生產(chǎn)DHA有影響。

2.2 化學(xué)因素

（1）碳氮比：培養(yǎng)基中的氮源組成主要影響微藻細(xì)胞內(nèi)飽和及不飽和脂肪酸的比例，當(dāng)培養(yǎng)基中C/ N比升高時(shí)，Chlorellasorokiniana細(xì)胞內(nèi)多不飽和脂肪酸的含量增大。同時(shí)培養(yǎng)基的碳、氮源的選擇也影響了微藻生產(chǎn)DHA的產(chǎn)量，這表現(xiàn)為不同的藻種對(duì)碳、氮源有不同的適應(yīng)性。

（2）氯化鈉：在海洋藻類中，鈉離子的作用主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)中胞內(nèi)外的滲透壓。在高鹽濃度下，藻細(xì)胞的細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透壓降低，多不飽和脂肪酸含量下降，DHA的含量也下降，而低鹽度下時(shí)DHA的含量較高。

2.3 微藻生產(chǎn)DHA的方式

（1）自養(yǎng)方式

對(duì)光合自養(yǎng)的微藻進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)一些光合自養(yǎng)微藻能產(chǎn)生 DHA。如光甲藻和隱甲藻中，DHA是磷脂酰膽堿的主要成分，特別是隱甲藻體內(nèi)，將近總脂肪酸的50%的成分為 DHA。人們也已經(jīng)從海藻中發(fā)現(xiàn)DHA，含量占總脂肪酸的12%~36%。光合自養(yǎng)微藻的大規(guī)模培養(yǎng)多采用開(kāi)放式池、封閉式池和封閉式光合生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）異養(yǎng)方式

與自養(yǎng)培養(yǎng)方式相比，其具有培養(yǎng)過(guò)程無(wú)需光照，減少能量；可具有較大的培養(yǎng)密度，可提高底物的轉(zhuǎn)化率，縮短了發(fā)酵周期;能控制溫度、溶氧等培養(yǎng)參數(shù)。

目前，已經(jīng)成功地進(jìn)行了隱甲藻異養(yǎng)及混養(yǎng)的研究。

2.4 影響真菌合成DHA的因素

2.4.1 培養(yǎng)基的組成

（1）碳源：真菌發(fā)酵生產(chǎn) DHA時(shí)，不同的碳源對(duì)生物量、菌體脂質(zhì)量和脂質(zhì) DHA含量都有極大的影響�？傮w而言，葡萄糖是較佳的碳源，生物量、菌體脂質(zhì)量、脂質(zhì)DHA含量以及DHA產(chǎn)量都是較高的。葡萄糖也是油脂發(fā)酵生產(chǎn)中***常使用的碳源，而且可被有效轉(zhuǎn)化為油脂。

（2）氮源：氮的數(shù)量和來(lái)源對(duì)真菌合成多不飽和脂肪酸有著重要的影響。酵母抽提物、 谷氨酸鈉和胰蛋白胨有利于Thraustochytriumaureum ATCC 34304的生長(zhǎng)，其中以酵母抽提物的生物量******，谷氨酸鈉還有利于脂質(zhì)的積累，各種氮源對(duì)脂質(zhì)DHA的含量影響不是十分明顯，從DHA的產(chǎn)量看，酵母抽提物和谷氨酸鈉為較好的氮源。

（3）碳氮比：除了碳源、氮源外，培養(yǎng)基中碳氮比也影響真菌合成DHA。 微生物生長(zhǎng)于碳源過(guò)剩、氮源不足，或者是剝奪氮源的環(huán)境，便會(huì)激發(fā)和促進(jìn)脂質(zhì)的積累作為碳及能源的備用庫(kù)。一般情況下高的碳氮比有利于脂質(zhì)的積累和促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，但碳氮比過(guò)高，脂質(zhì)中DHA含量將會(huì)下降。

（4）無(wú)機(jī)鹽及微量元素：在培養(yǎng)海洋微生物時(shí)，除非培養(yǎng)基中含有足夠的所有必需微量元素，否則，較好采用天然海水。由于破囊壺菌和裂殖壺菌均為海生真菌，因此培養(yǎng)基中添加一定量無(wú)機(jī)鹽是非常必要的。

（5）前體促進(jìn)劑：一些有機(jī)酸和維生素對(duì)真菌合成 DHA也是十分有用的 。

2.4.2 通氣與攪拌

微生物合成多不飽和脂肪酸過(guò)程中的去飽和作用需要分子氧的參與，分子氧的有效性決定其產(chǎn)生脂肪酸的不飽和度。因此，提高培養(yǎng)基中氧濃度有利于不飽和脂肪酸的合成。機(jī)械攪拌對(duì)培養(yǎng)Thraustochytrium 和 Schizochytrium 生產(chǎn)DHA有不同的影響。由于Thraustochytrium缺乏細(xì)胞壁和富含不飽和脂肪酸，細(xì)胞脆性大，機(jī)械攪拌抑制其生長(zhǎng)。 但Schizochytrium的情況則不同，適當(dāng)提高攪拌速度能促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)。另外，攪拌器的葉輪類型對(duì)菌體的生長(zhǎng)也有影響。

2.4.3 初始pH值

真菌生產(chǎn)DHA時(shí),選擇適宜的初始 pH值也是十分重要的。

2.4.4 溫度對(duì)DHA的生產(chǎn)有著極其重要的影響

嗜冷微生物比嗜溫微生物能合成更多的多不飽和脂肪酸。許多研究也表明， 低溫能促進(jìn)微生物合成不飽和脂肪酸。Brown和Rose認(rèn)為，由于低溫增加氧的可溶性，產(chǎn)生大量胞內(nèi)分子氧，有利于需氧參與的長(zhǎng)鏈脂肪酸的去飽和作用。另外，低溫下，微生物產(chǎn)生大量多不飽和脂肪酸也是一種適應(yīng)低溫環(huán)境的手段，因?yàn)槎嗖伙柡椭�肪酸，特別是EPA、DHA能保持微生物細(xì)胞膜低溫流動(dòng)性，從而維持細(xì)胞正常功能。

2.4.5 種齡和接種量

種齡顯著影響Thraustochytriumaureum ATCC34304的脂質(zhì)積累和 DHA產(chǎn)量，對(duì)生物量和脂質(zhì)DHA含量影響不大，種齡24h和5%的接種量時(shí)脂質(zhì)積累和 DHA產(chǎn)量******。

2.4.6 光照

破囊弧菌和裂殖弧菌為具有光刺激生長(zhǎng)特性的海生真菌，因此，光照對(duì)其生產(chǎn)DHA也有影響，Thraustochytriumaureum ATCC34304在33W 熒光燈光照下的生物量、脂質(zhì)量和DHA產(chǎn)量都比黑暗培養(yǎng)時(shí)高。

2.4.7 培養(yǎng)時(shí)間

破囊弧菌和裂殖弧菌發(fā)酵初期的生物量和脂質(zhì)量呈線形增加，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期達(dá)到******，此后，生物量保持平穩(wěn)，而脂質(zhì)量有所下降。DHA含量隨培養(yǎng)時(shí)間變化并不明顯。

目前，研究多不飽和脂肪酸的合成途徑、去飽和酶基因的性質(zhì)、藻細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的組成、分布、DHA合成的途徑及合成前體物質(zhì)等也為多不飽和脂肪酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了更多的理論基礎(chǔ)。

四、DHA的分離提取

1、低溫分級(jí)法

利用不同的脂肪酸在過(guò)冷的有機(jī)溶劑中的溶解度差異來(lái)分離濃縮 DHA。即將總脂肪酸置于1~10倍的無(wú)水丙酮中 ,并冷卻至-25℃以下，混合液的下層為飽和的脂肪酸和低度的不飽和脂肪酸結(jié)晶，而上層含有大量的高度的不飽和脂肪酸的丙酮溶液，將混合液過(guò)濾，濾液在真空下蒸餾除去丙酮，就可得到較純的DHA。

2、溶劑提取法

利用不同脂肪酸的金屬鹽在某種有機(jī)溶劑中的差異來(lái)分離濃縮DHA。該種方法是通過(guò)皂化后，在皂液加入H2SO4，并將pH調(diào)至1~2 ，分離上層粗脂肪酸乙醇混合液，加入回收乙醇，并反復(fù)水洗粗脂肪酸至pH為中性。即可得相對(duì)較純的DHA。

3、尿素包合法

脂肪酸與尿素的結(jié)合能力取決于其不飽和程度，脂肪酸的不飽和程度越高，其于尿素結(jié)合的能力越弱。因而可將飽和脂肪酸、低度不飽和脂肪酸、高度不飽和脂肪酸分離開(kāi)來(lái)。然后，利用適當(dāng)?shù)娜軇┹腿�，真空干燥后可得�?/span>DHA含量較高的不飽和脂肪酸。

4、超臨界 CO2萃取法

超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，簡(jiǎn)稱 SFE)是近代發(fā)展起來(lái)的一種新型化工分離技術(shù)。它原理主要是將DHA溶于超臨界狀態(tài)的CO2中，通過(guò)改變溫度和壓力，達(dá)到分離DHA的目的。它能夠分離出較純的DHA，但是對(duì)含有相同的碳數(shù)而雙鍵不同的脂肪酸卻效果較差。此外，現(xiàn)在還具有脂肪酶水解法、膜分離法、硝酸銀層析法、******液相色譜法等。

5、酶法破碎

細(xì)胞破碎的方法而言可分為機(jī)械法和非機(jī)械法，機(jī)械法包括珠磨法、高壓勻漿法、超聲波法和微波法等；非機(jī)械法包括溶酶法、酸熱法和自溶法等。

酶解法是一種研究較廣的細(xì)胞破碎方法，它利用酶反應(yīng)，分解破壞細(xì)胞壁上的特殊鍵，從而達(dá)到破壁的目的。

自溶法是一種特殊的溶酶方式，其所需的溶胞酶是由微生物本身產(chǎn)生的。事實(shí)上，在微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，大多都能產(chǎn)生一定的水解自身細(xì)胞壁上聚合物結(jié)構(gòu)的酶，以便使生長(zhǎng)繁殖過(guò)程進(jìn)行下去。控制一定條件，可以誘發(fā)微生物產(chǎn)生過(guò)剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。目前常用的自溶促進(jìn)劑有食鹽、乙醇、甲苯、硫醇等。某些試驗(yàn)是通過(guò)在菌液加入NaCl使其達(dá)到一定的濃度進(jìn)行處理的。不溶固形物的含量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而減少，這是因?yàn)?/span>NaCl溶液中，存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞膜發(fā)生破裂，使得細(xì)胞水解酶與底物接觸而被激活，分解細(xì)胞，原生質(zhì)外溢，胞內(nèi)產(chǎn)物釋放致使不溶固形物減少。

自溶作用是酶解的另一種方法，在一定程度上能用于工業(yè)生產(chǎn)，但對(duì)不穩(wěn)定的微生物則容易引起蛋白質(zhì)變性，自溶后細(xì)胞培養(yǎng)液過(guò)濾速度也會(huì)降低。

其使用方法為：溶菌酶是專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，酶解條件為：pH值7·2的0·2 mol·L-1的磷酸鉀緩沖溶液， 0·8 mol·L-1的氯化鉀溶液，0·5%的溶菌酶。在30℃將菌體振蕩不同時(shí)間后離心，菌體酶解后加入丙酮。影響因素：溫度、PH、自溶時(shí)間等對(duì)自溶效果都有影響，根據(jù)菌體的不同而有不同的影響。

酶法破碎的缺點(diǎn)：酶法避免了大量有機(jī)溶劑的使用，但酶作用的條件比較苛刻，這給過(guò)程的操作帶來(lái)麻煩。

目前很多是將酶法與其它各種細(xì)胞破碎方法結(jié)合起來(lái)，如酶解-超聲波法，酶解-高壓破碎法等。